Содержание книги Предыдущая статья Следующая статья


Методология флоуметрии, 1997 г. стр.107-124.

Возможности и перспективы использования ультразвукового и лазерного флоуметров фирмы "Тransonic Systems Inc." для экспериментальных фармакологических исследований

Давыдова С.А., Зарецкий Д.В., Бычкова Е.Ю.,
Медведев О.С.

Кафедра фармакологии факультета фундаментальной медицины
МГУ им.М.В.Ломоносова,
Лаборатория экспериментальной фармакологии НИИ Экспериментальной кардиологии
Кардиологического научного комплекса Минздрава РФ

Введение

Уровень доклинических испытаний различных фармакологических препаратов, также как и грамотность постановки и решения научных задач, во многом зависят от степени технической оснащенности исследовательских лабораторий. Фармакология сердечно-сосудистой системы всегда нуждалась в корректных методах оценки функции сердца и сосудов. В настоящее время прямая регистрация артериального давления при помощи внутрисосудистых катетеров стала рутинным методом эксперимента. Однако, регистрация только артериального давления не дает объективного представления о состоянии и ответных реакциях сердца и сосудов.

Параллельное мониторирование артериального давления и сердечного выброса позволяет анализировать сердечный и сосудистый компоненты действия фармакологических средств. Для оценки сердечного выброса наиболее адекватно использование ультразвуковой флоуметрии с регистрацией объемной скорости кровотока в восходящей части дуги аорты.

Ряд фармакологических задач предполагает изучение органной специфичности сосудистых ответов. Решение этой задачи возможно с применением ультразвукового флоуметра для регистрации кровотока в соответствующих артериальных сосудах, например, почечной, сонной или бедренной артериях. Для измерения локального тканевого кровотока самостоятельное значение имеет применение флоуметров, основанных на измерении допплеровского сдвига частоты, возникающего при отражении лазерного луча от движущихся по капиллярам эритроцитов.

Необходимо учитывать, что основным объектом фармакологических исследований являются крысы ввиду экономичности и удобства работы. Это накладывает особые требования на размеры имплантируемых датчиков, которым удовлетворяет аппаратура фирмы "Transonic Systems Inc.", опыт работы с которой представлен в предлагаемом обзоре оригинальных экспериментальных данных.

Возможности применения ультразвуковой и лазерной флоуметрии для решения фармакологических задач

Для оценки возможностей применения флоуметрических методов в фармакологических исследованиях предлагаем рассмотреть результаты демонстрационного эксперимента, проведенного на наркотизированной уретаном (2.0 г/кг) крысе, которой были установлены следующие флоуметрические датчики:

Кроме того были введены полиэтиленовые катетеры: для регистрации артериального давления - в брюшную аорту через правую бедренную артерию, для системного введения препаратов - в нижнюю подвздошную вену через правую бедренную вену.

Эксперимент был проведен в условиях открытой грудной клетки с применением искусственной вентиляции легких (1 мл/100 г /вдох с частотой 55 в мин) аппаратом 7025 Rodent Ventilator (Ugo Basile, Italy). Это определяло невысокие фоновые значения регистрируемых параметров давления и кровотоков.

Регистрацию сигналов осуществляли с помощью компьютерной системы анализа физиологических сигналов в реальном масштабе времени MacLab на базе компьютера типа Macintosh.

На рисунке 1 представлены оригинальные кривые артериального давления и кровотоков в аорте, сонной артерии и дорзальной поверхности центральной доли мозжечка. Необходимо отметить высокую разрешающую способность регистрирующей аппаратуры, позволяющей качественно и количественно анализировать все фазы сердечного цикла, несмотря на высокую частоту сокращений сердца крысы (около 350 ударов в минуту).

Рис.1. Оригинальные кривые регистрируемых параметров. Частота оцифровки - 400 Гц.

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности центральной доли мозжечка (tissue perfusion units, ТРU).

В качестве примера предлагаем обратить внимание на хорошее разрешение кратковременных фаз обратного тока крови в аорте и сонной артерии, связанных с функционированием аортального клапана и распространением пульсовой волны по сонной артерии, соответственно.

Одновременность регистрации нескольких сигналов представляет для исследователя особую ценность, поскольку предоставляет возможность анализа различных аспектов действия фармакологических препаратов.

Во-первых, она позволяет учитывать временные характеристики каждого из сигналов (например, интервал между максимумами величин кровотоков в сосудах разной локализации и диаметра). Во-вторых, получать расчетные параметры, такие как общее периферическое сосудистое сопротивление (отношение величины среднего артериального давления к величине сердечного выброса).

Основываясь на вышесказанном, предлагаемый далее экспериментальный материал представлен в виде синхронной записи всех четырех регистрируемых сигналов с одновременным расчетом как средних величин, так и пересчетных параметров.

При исследовании состояния и ответных реакций сердечно-сосудистой системы применяется ряд тестирующих препаратов. К их числу относится нитропруссид натрия, действие которого представлено на рисунке 2.

Внутривенная инфузия донора оксида азота нитропруссида натрия приводит к расширению периферических артериальных сосудов и уменьшению общего периферического сосудистого сопротивления (рис.2H). Значительное снижение артериального давления (рис.2А) сопровождается уменьшением сердечного выброса (рис.2В, 2F). Вызванное уменьшение перфузионного давления в периферических артериях определяет снижение кровотока в сонной артерии (рис.2С, 2G), а также локального кровотока в органах (рис.2D), хотя и не столь выраженное.

Рис.2. Динамика изменения регистрируемых и расчетных параметров при внутривенной инфузии нитропруссида натрия (30 мкг/мин/кг). Частота оцифровки - 100 Гц.

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности червя мозжечка (ТРU),

E - среднее артериальное давление (мм рт.ст.),

F - средний кровоток в аорте (мл/мин),

G - средний кровоток в сонной артерии (мл/мин),

H - общее периферическое сосудистое сопротивление (мм рт.ст./мл/мин).

Следует отметить, что разрешающая способность ультразвукового флоуметра позволяет оценить изменение состояния стенок крупных артериальных сосудов при введении вазоактивных веществ. Если в начале опыта интервал времени между максимумом кровотока в аорте и артериального давления в брюшной аорте составлял для данной крысы 52-55 мсек, то при действии нитропруссида натрия оно увеличилось до 60-62 мсек, что соответствует увеличению растяжимости и снижению тонуса крупных артерий.

В представленном эксперименте временные интервалы измерялись при частоте оцифровки сигналов 400 Гц, что определялось только производительностью компьютера Macintosh 2VX. Использование большей частоты оцифровки (1000 Гц и более) может позволить оценивать этот параметр в случае более близкого расположения датчиков. Например, расстояние между максимумами сигналов кровотоков в аорте и сонной артерии составляло приблизительно 10 мсек и его вариации не могли быть оценены при низкой частоте оцифровки.

На рисунке 3 представлен результат механического пережатия сонной артерии, что проявляется прекращением кровотока в данном сосуде (рис.3С) и, как следствие, снижением кровотока в мозжечке (рис.3D) при неизменном сердечном выбросе (рис.3В) и незначительно увеличенном артериальном давлении (рис.3А). По окончании кратковременной окклюзии наблюдалось восстановление кровотока в сонной артерии и кратковременное увеличение локального мозгового кровотока. Неизменность артериального давления и сердечного выброса позволяет говорить о локальном характере ответной реакции мозгового кровотока на ишемию, что в настоящее время интенсивно изучается как с точки зрения механизмов, так и способов фармакологической коррекции (McLaughlin M.R., Marion D.W., 1996; Hosomi N. et al., 1996; Zhang Z.G. et al., 1996; Lin P.J. et al., 1996; Roda J.M. et al., 1996).

 

Рис. 3. Динамика изменения регистрируемых параметров при окклюзии сонной артерии.

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности центральной доли мозжечка (tissue perfusion units, ТРU).

Частота оцифровки - 100 Гц.

Проблемой изучения физиологических параметров является устойчивость используемой аппаратуры к различным физическим воздействиям, например, электрической стимуляции органов и тканей. В частности, применение этого физиологического подхода значительно усложняет использование электромагнитного флоуметра. Поэтому в демонстрационном эксперименте нами была оценена устойчивость регистрации физиологических параметров при однократной и ритмической электростимуляции передней поверхности левого желудочка сердца (рис.4) и мышц брюшной стенки (рис.5).

Рис. 4. Динамика изменения регистрируемых параметров при электрической стимуляции сердца.

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности центральной доли мозжечка (tissue perfusion units, ТРU).

Частота оцифровки - 100 Гц.

Однократная электрическая стимуляция сердца (1.5V; 10 мсек; биполярные стальные электроды на основании и верхушке сердца) приводила к возникновению атипичного сокращения, что отражалось на динамике артериального давления (рис.4А), сигнале кровотоков в аорте (рис.4В) и сонной артерии (рис.4С), а также отставленном во времени приблизительно на один цикл снижении локального мозгового кровотока (рис.4D).

Рис. 5. Динамика изменения артериального давления, сердечного выброса, кровотоков в сонной артерии и мозжечке при электрической стимуляции мышцы брюшной стенки.

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности центральной доли мозжечка (tissue perfusion units, ТРU).

Частота оцифровки - 100 Гц.

При ритмической стимуляции мышц брюшной стенки электрическими стимулами высокого напряжения (50 V; 10 мсек; 20 Гц) наблюдались изменения артериального давления (рис.5А), кровотока в сонной артерии (рис.5С) и мозжечке (рис.5D) при сохранении сердечного выброса (рис.5B). Высокое качество получаемых сигналов сохранялось, несмотря на большие значения приложенного электрического напряжения.

Эвтаназию животного в конце эксперимента осуществляли передозировкой общего анестетика (уретан, 20 г/кг). По мере углубления наркоза можно было наблюдать прогрессирующее снижение сердечной деятельности, проявляющееся уменьшением артериального давления, частоты сокращений (рис.6А) и ударного объема (рис.6В). По мере уменьшения артериального давления происходили соответствующие изменения кровотока в сонной артерии (рис.6С). Резкое снижение диастолического артериального давления и возрастание интервала между сокращениями сопровождались появлением выраженных пульсовых волн локального мозгового кровотока (рис.6D), величина которых кореллировала с величиной ударного объема.

Рис. 6. Динамика изменения артериального давления, сердечного выброса, кровотоков в сонной артерии и мозжечке при прогрессирующем снижении сердечной деятельности при введении повышенной дозы уретана (20 г/кг).

А - артериальное давление (мм рт.ст.),

В - кровоток в аорте (мл/мин),

С - кровоток в сонной артерии (мл/мин),

D - кровоток в дорзальной поверхности центральной доли мозжечка (tissue perfusion units, ТРU).

Частота оцифровки - 100 Гц.

Полное прекращение сердечных сокращений приводило к уменьшению объемного кровотока в обоих сосудах до нулевых значений, тогда как показания лазерного допплеровского флоуметра не опустились ниже 0,9 TPU, что связано с наличием так называемого "биологического нуля" (Laser Doppler, 1994). Его величина, как правило, хорошо воспроизводится для конкретной биологической ткани, и обычно вычитается из получаемых экспериментальных значений (Tenland T. et al., 1983).

Представленные экспериментальные результаты показывают возможность комплексной оценки состояния сердечно-сосудистой системы в физиологических и фармакологических исследованиях при использовании флоуметрических методов.

Применение ультразвуковой флоуметрии в хронических экспериментах

Для фармакологических исследований крайне важен хронический эксперимент, так как только у бодрствующего животного можно в полном объеме наблюдать компенсаторные реакции в ответ на введение лекарственных средств. Следует отметить, что к животному, предназначенному для хронических экспериментов, предъявляются особые требования по устойчивости работы имплантированных датчиков. Двигательная активность, неизбежная в хроническом эксперименте, зачастую искажает регистрируемые сигналы. При работе с датчиками объемного кровотока фирмы "Transonic Systems Inc." мы не встретились с подобными проблемами, наблюдая стабильный и четкий сигнал.

Устойчивую работу аортальных датчиков кровотока мы наблюдали в столь жестких экспериментальных условиях, как иммобилизационный стресс (рис.7). Можно обратить внимание, что даже при появлении артефактов сигнала артериального давления при интенсивных движениях животного, сигнал кровотока в аорте остается стабильным.

Рис. 7. Оригинальные кривые артериального давления и кровотока в аорте при иммобилизационном стрессе у бодрствующей крысы. Частота оцифровки - 400 Гц.

A - артериальное давление (мм рт.ст.)

B - кровоток в аорте (мл/мин).

Фирмой "Transonic Systems Inc." предлагается ряд датчиков, соответствующих диаметру аорты крыс различного веса. Например, для аорты крыс до 250 г подходят датчики диаметром 2мм - 2SB, 2SS, 2RB и 2RS, весом более 250 г - размером 2.5мм типов 2.5SS, 2.5SB и 2.5SL.

Использование ультразвуковой флоуметрии в хронических экспериментах сопряжено с решением ряда проблем, связанных с хирургической техникой постановки датчика. Увеличение выживаемости после торакальной операции в постоперационный период может быть достигнуто за счет использования датчиков S-серии с уменьшенным объемом имплантируемой части.

Данные флоуметрических измерений, получаемые в хронических экспериментах, также приобретают особую ценность при их комбинированном использовании. Типичные кривые артериального давления и объемного кровотока в аорте при введении стандартных тестирующих веществ нитропруссида натрия и фенилэфрина показаны на рисунках 8 и 9.

Значимость получаемых методом ультразвуковой флоуметрии результатов позволяет надеяться, что дальнейшее совершенствование аппаратурного обеспечения и хирургической техники дадут возможность широкого использования метода в экспериментальной фармакологии сердечно-сосудистой системы.

Рис. 8. Динамика изменений артериального давления, кровотока в аорте и общего периферического сосудистого сопротивления при внутривенном введении нитропруссида натрия (НП, 50 мкг/кг) бодрствующей крысе. Частота оцифровки - 100 Гц.

A - фрагменты оригинальной кривой артериального давления (мм рт.ст.),

B - фрагменты оригинальной кривой кровотока в аорте (мл/мин),

C - динамика среднего артериального давления (мм рт.ст.),

D - динамика усредненного кровотока в аорте (мл/мин),

E - динамика общего периферического сосудистого сопротивления (мм рт.ст./мл/мин).

Рис. 9. Динамика изменения артериального давления (A), кровотока в аорте (B) и общего периферического сосудистого сопротивления (С) при внутривенном введении фенилэфрина (ФЭ, 50 мкг/кг) бодрствующей крысе. Частота оцифровки - 100 Гц.

A - фрагменты оригинальной кривой артериального давления (мм рт.ст.),

B - фрагменты оригинальной кривой кровотока в аорте (мл/мин),

C - динамика среднего артериального давления (мм рт.ст.),

D - динамика усредненного кровотока в аорте (мл/мин),

E - динамика общего периферического сосудистого сопротивления (мм рт.ст./мл/мин).

Возможности локального введения препаратов при изучении регуляции локального кровотока

Метод лазерной допплеровской флоуметрии позволяет непрерывное измерение локального кровотока в небольших участках биологических тканей. Экспериментально показано хорошее соответствие между различными методами оценки изменений кровотока, вызванных введением вазоактивных препаратов или окклюзией сосудов, в частности, лазерной допплеровской флоуметрией и методом меченых микросфер (Lindsberg P.J. et al., 1988; Dirnagl U., 1989).

Значительные флуктуации кровотока при одинаковых условиях измерений в течение нескольких последовательных дней создают значительные сложности при исследовании длительно развивающихся эффектов фармакологических препаратов на микроциркуляцию. Поэтому основной сферой применения лазерной допплеровской флоуметрии является исследование быстрых эффектов лекарственных средств, о чем шла речь выше, либо оценка состояния регуляторных систем с помощью стандартных фармакологических препаратов.

Однако, системное введение вазоактивных веществ, как правило, меняет артериальное давление, что затрудняет интерпретацию наблюдаемых изменений локального кровотока. Поэтому нами была предпринята попытка использовать технологию микродиализа для локального введения препаратов в различные отделы головного мозга крыс при одновременном мониторировании локального кровотока методом лазерной допплеровской флоуметрии.

Структура комплексного датчика приведена на рисунке 10.

Рис. 10. Конструкция микродиализатора, совмещенного со световодом лазерного доплеровского флоуметра.

1 - полимерный световод,

2 - кремниевый капилляр в полиэтиленовой оболочке (OD=0.15 мм) для подачи раствора Рингера с фармакологическими препаратами,

3 - полупроницаемая мембрана,

4 - изолирующая полиэтиленовая трубка (PE-90),

5 - металлическая игла-держатель (OD=0.6 мм),

6 - эпоксидный клей.

В качестве стандартных препаратов для сравнения эффектов вазоактивных фармакологических веществ при системном и локальном введении были выбраны нитропруссид натрия (вазодилятатор) и фенилэфрин (вазоконстриктор).

При системном введении нитропруссид натрия вызывает снижение кровотока (рис.2D). Перфузия раствора нитропруссида натрия (1-50 мг/мл) через микродиализатор значительно увеличивает величину кровотока (рис.11), в то время как раствор фенилэфрина (1-50 мг/мл) не приводит к изменению этого показателя (рис.12). Изменение кровотока при перфузии раствора нитропруссида натрия было обратимым, и показатель возвращался к исходным значениям после отмывки препарата (рис.11).

Рис. 11. Типичная динамика мозгового кровотока при локальном введении через диализатор раствора нитропруссида натрия (5 мг/мл) (оригинальная кривая). Частота оцифровки - 2 Гц.

Различия эффектов вазоактивных фармакологических препаратов при системном и локальном введении можно объяснить следующим образом.

Локальное введение нитропруссида натрия вызывает вазодилятацию, что при сохраненном артериальном давлении проявляется повышением кровотока.

При системном введении нитропруссида натрия значительно падает артериальное давление. Поэтому величина локальной перфузии будет зависеть от соотношения снижения артериального давления и локального сопротивления сосудов.

Локальное введение фенилэфрина не приводит к достоверному уменьшению локального мозгового кровотока. Это свидетельствует об отсутствии констрикции мозговых сосудов при введении альфа-адреномиметиков, что согласуется с данными о влиянии фенилэфрина на сопротивление сосудов мозга (Johnston et al., 1994).

Рис. 12. Типичная динамика мозгового кровотока при локальном введении через диализатор раствора фенилэфрина (50 мг/мл) (сглаженная кривая). Частота оцифровки - 2 Гц.

Рис. 13. Типичная динамика мозгового кровотока при локальном введении через диализатор раствора L-NAME (3 мг/мл). Сглаженная кривая.

Учитывая высокую эффективность донора оксида азота, а, следовательно, возможную физиологическую роль эндогенного оксида азота, мы оценили влияние локальной блокады его синтеза на кровоток. Введение через диализатор ингибитора NO-синтазы L-NAME (L-nitro-arginine methyl ester) привело, как и ожидалось, к снижению кровотока на 20-30 % (рис.12.13.).

Таким образом, использование локального введения фармакологических препаратов позволяет изучать регуляцию локального кровотока, минуя системные эффекты изучаемых веществ.

Разработка метода локального введения фармакологических препаратов, совмещенного с мониторированием локального мозгового кровотока, проведена в рамках Гос.контракта РКА-ИМБП шифр "Наука-НАСА" # 9590/48.

Заключение

Представленный материал позволяет отметить высокую стабильность и точность работы приборов, а также несомненную ценность получаемых с их использованием результатов. Особое значение имеет возможность использования флоуметрии в сочетании с другими методами исследования сердечно-сосудистой системы.

Литература

  1. Dirnagl U., Kaplan B., Jacewicz M., Pulsinelli W. (1989) Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in rat stroke model. J.Cereb.Blood Flow and Metab. 9,589-596.
  2. Haywood J.R., Shaffer R.A., Fastenow C., Fink G.D., Brody M.J. (1981) Regional blood flow measurement with pulsed Doppler flowmeter in conscious rat. Am.J.Physiol. 241 (Heart Circ. Physiol. 10): H273-H278.
  3. Hosomi N., Tsuda Y., Ichihara S.I., Kitadai M., Ohyama H., Matsuo H. (1996) Duration threshold of induced hypertension on cerebral blood flow, energy metabolism, and edema after transient forebrain ischemia in gerbils. J.Cereb.Blood Flow Metab., 16(6): 1224-9.
  4. Johnston W.E., DeWitt D.S., Vinten-Johansen J. et al. (1994) Phenylephrine does not reduce cerebral perfusion during canine cardiopulmonary bypass. Anesth.Analg.79 (1): 14-18.
  5. Laser Doppler. G.Belcaro, U.Hoffmann, A.Bollinger, A.Nicolaides (Eds.). Med-Orion Publishing Company, 1994.
  6. Lin P.J., Chang C.H., Tan P.P., Chang C.N., Lee S.T., Wang C.C., Chang J.P., Liu D.W., Chu J.J., Tsai K.T., Kao C.L., Hsieh M.J., Hua M.S. (1996) Prolonged circulatory arrest in moderate hypothermia with retrograde cerebral perfusion. Is brain ischemic? Circulation 94(9 Suppl): II169-72.
  7. Lindsberg P.J., O'Neill J.T., Paakkari I., Hallenbeck J, Feuerstein G. (1988) Validation of laser-Doppler velocimetry in the CNS. Soc.Neurosci.Abstr. 14, 995.
  8. McLaughlin M.R., Marion D.W. (1996) Cerebral blood flow and vasoresponsivity within and around cerebral contusions. J.Neurosurg. 85(5): 871-6.
  9. Roda J.M., Carceller F., Diez-Tejedor E., Avendano C. (1996) Reduction of infarct size by intra-arterial nimodipine administered at reperfusion in a rat model of partially reversible brain focal ischemia. Stroke 26(10): 1888-92
  10. Zhang Z.G., Reif D., Macdonald J., Tang W.X., Kamp D.K., Gentile R.J., Shakespeare W.C., Murray R.J., Chopp M. (1996) ARL 17477, a potent and selective neuronal NOS inhibitor decreases infarct volume after transient middle cerebral artery occlusion in rats. J.Cereb.Blood Flow Metab. 16(4): 599-604.

Содержание книги Предыдущая статья Следующая статья Наверх к началу